骨肉瘤中发现DANCR作为ceRNA促进增殖和转移

骨肉瘤中发现DANCR作为ceRNA促进增殖和转移
原创： genie 宇宙实验媛 1周前
骨肉瘤是一种常见的恶性骨肿瘤，生长快增殖早是其不良预后的主要原因。由于其恶性生物学行为，在患者第一次就诊时出现肺转移约20%。因此，寻找一种关键的骨肉瘤转移相关分子并确定其在骨肉瘤中的潜在机制是迫切需要的。越来越多的证据表明，非编码RNA包括lncRNA和miRNA在骨肉瘤中起关键的调节作用。lncRNA能作为miRNA的海绵来调控基因表达，研究表达异常的lncRNA、miRNA以及其在癌症中的功能已成为研究的热点。

今天想分享一篇研究lncRNA的文章《Long noncoding RNA DANCR, working as a competitive endogenous RNA, promotes ROCK1-mediated proliferation and stasis via decoying of miR-335-5p and miR-1972 in osteosarcoma》，文章发表在Molecular Cancer (IF:7.776).其中第一作者为沈阳医学院附属中心医院的Yong Wang和Xiandong Zeng。

文献检索会看到一般最普通的研究ceRNA机制的，就是最上游一个lncRNA负调控一个miRNA，这个miRNA又能靶向结合在某些靶分子的非编码区下调其水平。这样的研究套路已经非常透彻了，今天分享的文章不能免俗，但是又有些许的不一样，请继续阅读。下面是正文解读~

DANCR高表达与病理分型的关系
首先作者在临床样本中检测到DANCR高表达，DANCR的表达并与临床分期，淋巴结转移及远端转移相关。并在不同的骨肉瘤细胞系中也得到DANCR高表达的结果。

图1.DANCR在骨肉瘤组织中升高与患者预后不良有关

下调DANCR抑制细胞增殖侵袭迁移
在临床样本中得到的数据证明研究DANCR是非常有价值的，于是作者选取了两个骨肉瘤细胞系（之前验证过DANCR高表达）MNNG/HOS和143B来做机制的研究。用sh-DANCR和pcDNA-DANCR来敲低和过表达DANCR的水平后，检测了增殖，侵袭及迁移这些肿瘤研究的基本表型。结果发现下调DANCR能抑制骨肉瘤细胞增殖侵袭迁移能力。

图2.DANCR促进细胞的增殖和迁移/侵袭

抑制ROCK1下调细胞的增殖侵袭迁移能力
紧接着作者将同样的套路再来一遍，在临床组织样本及骨肉瘤细胞系中发现ROCK1高表达，用sh-ROCK1和pcDNA-ROCK1来敲低和过表达ROCK1的水平后，检测了增殖，侵袭及迁移这些肿瘤研究的基本表型。结果发现抑制ROCK1的表达能下调骨肉瘤细胞的增殖侵袭迁移能力。

图3.Dancr通过上调ROCK1的表达促进细胞增殖和迁移/侵袭

miR-335-5p和miR-1972与ROCK1靶向结合
研究了ceRNA机制中的上游lncRNA，下游靶分子ROCK1，ceRNA中的中间环节miRNA也该出场了。于是用生物信息学方法预测(http://www.targetscan.org/vert_71)到在ROCK1的上游有两个miRNA可以与其靶向结合，分别miR-335-5p和miR-1972。这两个miRNA在组织水平和细胞水平都是低表达的，然后q-PCR检测发现DANCR与miRNA也呈负向调控的关系。

图4.DANCR与miR-335-5p和miR-1972相关性

miR-335-5p/miR-197靶蛋白是ROCK1
再转染miR-335-5p/miR-1972的mimic和inhibitor，通过一系列手段验证miR-335-5p和miR-1972与下游靶分子ROCK1是靶向结合，并下调其水平。

图5.ROCK1是miR-335-5p和miR-1972靶基因

DANCR靶向结合miR-335-5p/miR-197
miRNA与靶分子的关系得到验证，那lncRNA与miRNA的关系呢？别急，马上就来。在研究lncRNA与miRNA时，不仅使用到了双荧光素酶这种基本操作，还使用了RIP。在关系得到明确后，还是同样的配方熟悉的味道。用mimic/inhibitor来过表达和敲低miRNA的水平，检测肿瘤细胞的增殖侵袭迁移。

图6.DANCR通过与miR-335-5p和miR-1972上调ROCK1

动物水平进行验证
在细胞水平将ceRNA的机制研究通了，最后当然还是要在动物水平进行研究啦。刚才说的肿瘤的基本表型还记得吗？增殖侵袭迁移，在细胞实验里做过之后，同样要在动物实验中配套制作。

图7.DANCR升高对骨肉瘤体内肿瘤发生和肺转移的促进作用

小结
文章看似数据很多，但是其中的内容比较简单，机制研究也比较简单，就单单只是研究lncRNA-DANCR，miRNA-miR-335-5p/miR-1972, 靶分子ROCK1与肿瘤表型的关系，连信号通路都没有涉及。为什么能发到7-8分？第一，临床的数据非常重要；第二，lncRNA下游调控的不是只有一个miRNA，本文是做的一个lncRNA同时调控下游两个miRNA，而且这两个miRNA都有同样的靶分子，这也是本文的一个亮点。以本文为例，基础研究没有条件得到临床样本的数据，只做细胞实验和动物实验的话，能发个4分左右，运气好能不能投到将近5分或者突破5分，那就要看选的杂志了。研究的分子在此疾病背景的创新性，最下游的表型在此疾病中的研究多少都会决定了文章发表的影响因子。

无论什么疾病研究，无论什么机制研究，无论用什么套路，终究还是逃不过ABC法则。什么是ABC法则呢？敲黑板！！！A为疾病背景或者刺激因素，B为要研究的基因、蛋白、信号通路等，C为表型。A是不变的，B是通过文献检索发现在A的条件下有哪些是值得去研究的分子；C的研究确定了用什么样的实验方法，如果是细胞凋亡就是流式检测细胞凋亡，WB检测凋亡相关蛋白；如果是焦亡就是研究caspase-1、炎症小体等。以本文为例：在骨肉瘤疾病条件下，lncRNA-DANCR高表达引起miRNA-miR-335-5p/miR-1972低表达导致ROCK1的抑制被解除，骨肉瘤的增殖侵袭迁移增强。看，把ABC逻辑说通了，这就是一个完整的stroy，一个完整的研究。

这次的分享结束，希望大家能够喜欢。

文章链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5948795/

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